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    简明扼要地讨论了LBA测试方法在蛋白质生物药开发中的应用，以及与其它生物分析平台的比较。自上世纪60年代对胰岛素进行定量测定以来，基于与其它生物分子结合作用的LBA方法已被地用于生物分子的定量分析。例如，在蛋白质生物药开发过程中，这些方法为定量分析或检测蛋白质提供了一种准确和经济有效的方法。测试试剂（MAbs或PAbs）生成/选择是LBA方法开发过程中的关键步骤。一旦选择好了试剂，不同测试平台上的LBA方法能够提供的时间和成本效益。如前所述，另一个主要的大分子生物分析平台是液相色谱-质谱（LC-MS/MS）。在小分子药物的生物分析中，LC-MS/MS方法是无可置疑的；在大分子分析中，LC-MS/MS的重要性也在不断地增加，特别是在与LBA方法以某种形式组合之后。可以肯定，生物分析业界将继续探索LC-MS/MS在蛋白质药物的生物分析中的应用。生物分析行业必须证明LC-MS/MS，在药物开发的整个过程中，山东熙宁生物专业大分子生物分析平台方案，与LBA方法相比较，具有重现性（reproducibility）、可转移性（transferability），山东熙宁生物专业大分子生物分析平台方案，可靠性（reliability），和成本效益（cost–effectiveness），等方面的优势，山东熙宁生物专业大分子生物分析平台方案。多参数流式细胞术可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群，熙宁生物专业检测。山东熙宁生物专业大分子生物分析平台方案

    LBA要求至少使用一个生物分子来定量目标分析物；这个生物分子通常称为关键试剂，其特异性地结合目标分析物。LBA可分为两大类：（1）液相结合测试，其中目标分析物与标记过的检测试剂之间的结合反应发生在溶液相（图1A）；（2）固相结合测试，其中一个关键试剂被固定到固体表面，如微孔板或树脂（图1B），以捕获样本中的目标分析物。液相测试通常需要分离步骤，如色谱或电泳和/或离心，从而将目标分析物-标记检测试剂从未结合的分子中分离出来进行定量。这些分离过程冗长和/或繁琐。目前磁珠的应用缓解了这些挑战;然而，仍然需要分离步骤，如沉淀复合物（complexes）。大多数现代LBAs采用固定相测试，如微管、微孔板或有涂层的芯片。LBA测试方法是评估生物药的PK/TK时的主要定量分析方法；该方法的特异性和选择性取决于目标分析物与其他生物分子，如受体、针对候选生物药的抗体，和核酸适配体（aptamer），的相互作用。该方法中观察到的仪器响应与生物药的浓度间接相关，也就是说，检测信号的来源是酶化学反应或放射化学反应，而这些反应则是各种结合相互作用（bindinginteractions）的一部分。一般而言，大分子的物理化学特性无法直接产生检测信号。山东熙宁生物专业大分子生物分析平台方案生物大分子药物具有相对分子质量大、不易透过生物膜、给药剂量低、易在体内降解等特点。精翰生物专注检测。

    可诱导形成针对该生物药的抗体，特别是在临床前的动物试验中。这些由生物药诱导而形成的抗体通常被称为抗药物抗体（ADA），免疫检测方法是检测ADA是否存在在于血清中的级检测。不同的ADA反应，如表位特异性（，特异与非特异性）和数量（滴度或相对浓度），会影响对ADA和生物药的准确定量。由于ADAs会在血液循环中与生物药形成免疫复合物，高浓度的蛋白生物药能够干扰ADA的检测。在比较生物仿制药与创新药时以及对抗体-药物偶联物而言，对于生物分析的挑战和免疫原性评估的复杂性都增加了。备注：idiotype：免疫球蛋白（如IgG）可变区域的分子结构和构象，赋予其抗原特异性。；它们在大多数平台（如比色计或平面电化学发光）上，成本通常很低。当高亲和力MAbs用于LBAs时，LBA方法，在检测和定量分析存在于异质性的基质环境中的目标分析物方面，具有高度灵敏度和特异性。出于研究目的，该类方法的灵敏度可以低至每毫升毫微微克的级别（femtogram/mL）。大多数LBAs的操作程序不涉及样品分离的步骤，而基于LC-MS/MS的定量分析方法则需要。当然，LBA也有几个缺点。与LC-MS/MS方法相比，LBA方法的动态范围较狭窄。虽然用于基础研究的方法可以达到4-6个指数级的动态范围。

    为了生产MAbs，需要进一步分离单个淋巴细胞，并与骨髓瘤细胞融合，以产生不死的杂交瘤细胞，从而持续产生特定的MAb。因此，同一个克隆（clone）的抗体只识别一个抗原的单个表位。在ELISA中会频繁使用MAbs或PAbs，其选择（对于每种ELISA格式而言）取决于许多考虑因素：如，可及性（Availability）、亲和力、特异性（Specificity）和交叉反应性（Cross-reactivity）。特异性（Specificity）和交叉反应性（Cross-Reactivity）抗体的特异性（specificity）是特异性地结合相关抗原的能力，与ELISA方法的选择性（selectivity）不尽相同，但相关。选择性是一个定量分析方法，在其它潜在干扰成分存在的情况下，即从众多其它无关的蛋白质中，鉴别和定量测定目标分析物浓度的能力。交叉反应性（cross-reactivity）是指抗体与，除目标抗原之外，其它多个抗原结合的能力。当抗原（目标分析物）的与抗体试剂结合的表位与其它蛋白质相似时就会发生交叉反应。一般来说，特异性和交叉反应性对ELISA方法的选择性和基质效应有很大影响。如果使用高亲和力抗体作为捕获试剂，抗体/目标分析物的复合物就能够在含有多种蛋白质的“混合物”样品中有效地形成；基质效应会随之降低。中和抗体检测方法中具备很好的适应性，熙宁生物具有自主知识产权。

    直接式ELISA是较简单的ELISA格式，样品中的目标分析物吸附到微孔板的孔中。通过酶偶联试剂或标记检测抗体，直接实现目标分析物的检测，如图3B所示。图3.竞争式（Ai&Aii）、直接（B）和间接（C）ELISA测试格式的原理图。目标分析物（Analyte）被测定的目标蛋白质。在竞争式ELISA中，可以标记目标分析物或抗体；而在直接或间接ELISA格式中，只标记检测抗体。间接ELISA类似于直接ELISA，但主要（primary）抗体未被标记。目标分析物的检测是通过再次添加一个酶偶联试剂或标记检测抗体，使其与主要抗体结合，而实现的如图3C所示。直接ELISA更快速，因为它比间接ELISA少一个步骤。它通常用于需要快速完成的常规测试;商业化的家用怀孕测试是这种格式的一个例子。尽管间接ELISA涉及另一个步骤，但信号放大通常优于直接ELISA。因此，间接ELISA通常比直接ELISA更敏感，可以测量更低丰度的蛋白质。让来自样本的目标分析物直接吸附到微孔板有一些缺点。因为在洗板步骤中，可能洗掉目标分析物，因而可能增加测试的变异性。此外，非特异性地结合到微孔板的其它蛋白可能导致假阳性结果。为了克服这些挑战，其它可靠性更高的格式就演进出来了;其中有通常被称为夹心、桥联。精翰生物主要检测内容包含药代动力学(PK)，药效动力学(PD)，抗药抗体(ADA)，中和抗体(NAb)。山东熙宁生物专业大分子生物分析平台方案

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    样本中的胰岛素在溶液中与抗胰岛素血清结合（步骤1）。已知浓度的，I131标记的牛胰岛素被添加到反应溶液中（步骤2）；然后，样本中的胰岛素与I131标记的牛胰岛素（步骤3）相互竞争与抗体的结合。使用从人胰岛素制备的标准曲线，从与胰岛素抗体结合的I131标记牛胰岛素的浓度可以计算样本中被置换的胰岛素的浓度。3.常见的ELISA格式竞争式ELISA格式是基于初始的胰岛素RIA和IgGEIA方法中的结合竞争。来自样品的目标分析物（analyte）与参照分析物（referenceanalyte）与分析物特异性的抗体结合之间的竞争，是这种格式的关键。抗体或目标分析物都可以标记酶，并用于结合反应。使用标记抗体（图3Ai）时，参照分析物首先被动地吸附到微孔板的孔中。然后加入含有目标分析物的样本，如细胞裂解液、血清等，并与固定浓度的标记抗体一起孵育。样本中的目标分析物与固定的分析物竞争，以结合有限数量的标记抗体，随后的酶反应产生的信号与样本中目标分析物的浓度成反比。或者，可以使用固相吸附的抗体和标记分析物（图3Aii）。样本中的目标分析物与固定数量的标记分析物共同孵育，并与之相互竞争与固定抗体的结合。与前面的示例中一样，生成的信号与样本中目标分析物的浓度成反比。山东熙宁生物专业大分子生物分析平台方案