也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久,其中的可发生聚合,在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混匀宜轻缓,避免气泡,可上下颠倒混和,不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤,澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落,所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测,宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作,也可加入适当防腐剂。试剂的准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水,包括用于洗涤的,应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。加样在ELISA中一般有3次加样步聚,即加标本,加酶结合物,加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。加标本一般用微量加样器,按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴,以免发生交叉污染,也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定。
这样我们不仅能够知道检测的蛋白是否是多聚体、降解产物等,也能够同时检测不止一个目的蛋白。同时我们也应该从样本和目的蛋白种类进行考虑,如果需要检测的目的蛋白是血浆或血清中的分泌蛋白,那么ELISA可能更适合,但是本人也曾使用WB实验检测出IL-6、TNFα等分泌性炎症因子,所以,实验可能就是充满探究性!需要小伙伴根据自身情况考虑。二、ELISA实验过程中需要注意什么1.样本处理首先对于ELISA来说,正确的处理样本是保证检测准确性和正确性的第一步。正式实验之前好使用少量的样本进行预实验,可以选择2、5、10倍稀释样本,选择合适的稀释比例进行实验,亲身经历告诉大家,千万不能图省事,不然浓度太大超过检测限,简直就是赔了夫人又折兵!!!同时,样本的保存也非常重要,保存不当或在冰箱里保存过久的样本,血清中lgG可聚合成多聚体,导致结果偏高。建议五天内检测的血清样本可短暂存放4℃,一周之后测定的血清样本应该低温冻存,同时切忌反复冻融。如果是血清样本,也要主要样本不能有溶血、脂血和细菌等残留,这些样本中存在非特异性显色影响结果。(图片来自网络)2.标准品如何使用标准品的配置一般都是按照说明书进行的倍比稀释。
熙宁生物(Accurant BioTech Inc)是一家专业的符合国际GLP&GCP质量管理规范的大分子生物分析实验室,为国内外生物医药公司提供临床和临床前大分子生物分析的一站式服务,包括抗体制备,样本采集包及实验室手册,符合法规要求的分析方法的开发和验证,以及样本分析。包含药代动力学(PK), 药效学(PD),抗药抗体(ADA),中和抗体(NAb),生物标志物(Biomarker),及受体占位(RO) 免疫细胞分型,胞内因子,CART PK/PD等基于流式细胞术和 qPCR分析平台的相关检测。 公司领导团队平均有近20年的专业经验,多位在国际**药企和CRO工作多年的海归博士、大分子生物分析**、中美多个行业协会的常任理事,曾参与《中国药典2015版》“生物样品分析方法验证指导原则”,及多个国际上行业白皮书的撰写,支持过200+全球多中心临床试验,100+各类大分子产品。为多个国际重磅级药物提供上市审批数据支持。 公司在宁波(宁波熙宁检测技术有限公司)、上海(上海精翰生物科技有限公司)、美国新泽西(Accurant Bio)都建有实验室。
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